Dithiothreitol (DTT) je běžně používané redukční činidlo, známé také jako nové zelené aditivum.Je to malomolekulární organická sloučenina se dvěma merkaptanovými skupinami (-SH).Díky svým redukčním vlastnostem a stabilitě je DTT široce používán v biochemických a molekulárně biologických experimentech.
Hlavní úlohou DTT je redukce disulfidových vazeb v proteinech a dalších biomolekulách.Disulfidová vazba je důležitou součástí skládání a stability proteinu, ale za určitých experimentálních podmínek, jako je redukovatelná SDS-PAGE analýza, proteinová rekombinace a skládání, je nutné redukovat disulfidovou vazbu na dvě thiolové skupiny, aby se rozptýlila prostorová struktura protein.DTT může reagovat s disulfidovými vazbami a redukovat je na merkaptanové skupiny, čímž otevírá prostorovou strukturu proteinu a usnadňuje jeho analýzu a manipulaci.
DTT lze také použít k ochraně enzymové aktivity a stability.V některých reakcích katalyzovaných enzymem může být aktivita enzymu snížena oxidantem.DTT může reagovat s oxidanty a redukovat je na neškodné látky, čímž chrání aktivitu a stabilitu enzymu.
Ve srovnání s tradičními redukčními činidly, jako je β-merkaptoethanol (β-ME), je DTT považováno za bezpečnější a stabilnější redukční činidlo.Je nejen stabilní ve vodném roztoku, ale také si zachovává své redukční vlastnosti za vysoké teploty a acidobazických podmínek.
Použití DTT je poměrně jednoduché.Obecně se DTT rozpustí ve vhodném pufru a poté se přidá do experimentálního systému.Optimální koncentrace DTT musí být stanovena podle konkrétního experimentu a obecně se používá v rozmezí 0,1-1 mM.Nižší koncentrace mohou snížit nepříznivé účinky na buněčný růst a mohou snížit cytotoxicitu v důsledku nadměrné exprese cílových proteinů.Vyšší koncentrace mohou způsobit nadměrnou metabolickou zátěž buněk, ovlivnit buněčný růst a účinnost exprese.
Způsob, jak určit optimální koncentraci, může být vyhodnocení úrovně exprese cílového proteinu provedením IPTG indukčních testů při různých koncentracích.Testy na kultivaci v malém měřítku lze provádět s použitím řady koncentrací IPTG (např. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM atd.) a účinek exprese při různých koncentracích lze hodnotit detekcí úrovně exprese cílového proteinu (např. Western blot nebo fluorescenční detekce).Podle experimentálních výsledků byla jako optimální koncentrace vybrána koncentrace s nejlepším expresním účinkem.
Kromě toho se můžete také obrátit na příslušnou literaturu nebo na zkušenosti jiných laboratoří, abyste pochopili běžně používaný rozsah koncentrací IPTG za podobných experimentálních podmínek a poté je optimalizoval a upravoval podle experimentálních potřeb.
Je důležité poznamenat, že optimální koncentrace se může lišit v závislosti na různých expresních systémech, cílových proteinech a experimentálních podmínkách, takže je nejlepší optimalizovat případ od případu.
Stručně řečeno, DTT je běžně používané redukční činidlo, které lze použít k redukci disulfidových vazeb v proteinech a jiných biomolekulách a k ochraně enzymové aktivity a stability.Je široce používán v biochemických a molekulárně biologických experimentech.
Čas odeslání: 28. září 2023