Dithiothreitol (DTT) je běžně používané redukční činidlo, známé také jako nová zelená přísada. Jedná se o nízkomolekulární organickou sloučeninu se dvěma merkaptanovými skupinami (-SH). Díky svým redukčním vlastnostem a stabilitě se DTT široce používá v biochemických a molekulárně biologických experimentech.
Hlavní úlohou DTT je redukce disulfidových vazeb v proteinech a dalších biomolekulách. Disulfidová vazba je důležitou součástí skládání a stability proteinů, ale za určitých experimentálních podmínek, jako je analýza redukovatelné SDS-PAGE, rekombinace a skládání proteinů, je nutné redukovat disulfidovou vazbu na dvě thiolové skupiny, aby se rozpadla prostorová struktura proteinu. DTT může reagovat s disulfidovými vazbami a redukovat je na merkaptanové skupiny, čímž otevírá prostorovou strukturu proteinu a usnadňuje jeho analýzu a manipulaci.
DTT lze také použít k ochraně aktivity a stability enzymu. V některých enzymaticky katalyzovaných reakcích může být aktivita enzymu snížena oxidačním činidlem. DTT může reagovat s oxidačními činidly a redukovat je na neškodné látky, čímž chrání aktivitu a stabilitu enzymu.
Ve srovnání s tradičními redukčními činidly, jako je β-merkaptoethanol (β-ME), je DTT považován za bezpečnější a stabilnější redukční činidlo. Je nejen stabilní ve vodném roztoku, ale zachovává si své redukční vlastnosti i za vysokých teplot a v acidobazických podmínkách.
Použití DTT je relativně jednoduché. Obecně se DTT rozpustí ve vhodném pufru a poté se přidá do experimentálního systému. Optimální koncentrace DTT musí být stanovena podle konkrétního experimentu a obecně se používá v rozmezí 0,1–1 mM. Nižší koncentrace mohou snížit nepříznivé účinky na růst buněk a snížit cytotoxicitu v důsledku nadměrné exprese cílových proteinů. Vyšší koncentrace mohou způsobit nadměrnou metabolickou zátěž buněk, což ovlivňuje růst buněk a účinnost exprese.
Optimální koncentraci lze stanovit vyhodnocením hladiny exprese cílového proteinu provedením indukčních testů IPTG při různých koncentracích. Testy v malém měřítku lze provádět s použitím řady koncentrací IPTG (např. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM atd.) a účinek exprese při různých koncentracích lze vyhodnotit detekcí hladiny exprese cílového proteinu (např. Western blot nebo fluorescenční detekce). Podle experimentálních výsledků byla jako optimální koncentrace vybrána koncentrace s nejlepším účinkem exprese.
Kromě toho se můžete také odkázat na příslušnou literaturu nebo zkušenosti jiných laboratoří, abyste pochopili běžně používaný rozsah koncentrací IPTG za podobných experimentálních podmínek, a poté jej optimalizovat a upravit podle experimentálních potřeb.
Je důležité si uvědomit, že optimální koncentrace se může lišit v závislosti na různých expresních systémech, cílových proteinech a experimentálních podmínkách, takže je nejlepší optimalizovat případ od případu.
Stručně řečeno, DTT je běžně používané redukční činidlo, které lze použít k redukci disulfidových vazeb v proteinech a dalších biomolekulách a k ochraně aktivity a stability enzymů. Široce se používá v biochemických a molekulárně biologických experimentech.
Čas zveřejnění: 28. září 2023