IPTG (isopropyl-β-D-thiogalaktosid) je analog substrátu β-galaktosidázy, který je vysoce indukovatelný. Při indukci IPTG může induktor tvořit komplex s represorovým proteinem, takže se změní konformace represorového proteinu, takže se nemůže spojit s cílovým genem a cílový gen se efektivně exprimuje. Jak by se tedy měla stanovit koncentrace IPTG během experimentu? Čím větší, tím lepší?
Nejprve si vysvětlíme princip indukce IPTG: Laktózový operon (element) E. coli obsahuje tři strukturní geny, Z, Y a A, které kódují β-galaktosidázu, permeázu a acetyltransferázu. lacZ hydrolyzuje laktózu na glukózu a galaktózu, respektive na alolaktózu; lacY umožňuje laktóze z prostředí projít buněčnou membránou a vstoupit do buňky; lacA přenáší acetylovou skupinu z acetyl-CoA na β-galaktosid, což zahrnuje odstranění toxického účinku. Kromě toho existuje operační sekvence O, startovací sekvence P a regulační gen I. Kód genu I je represorový protein, který se může vázat na pozici O operátorové sekvence, takže operon (meta) je represován a deaktivován. Před iniciační sekvencí P se také nachází vazebné místo pro vazebné místo CAP pro katabolický aktivátor genu. Sekvence P, sekvence O a vazebné místo CAP společně tvoří regulační oblast lac operonu. Kódující geny těchto tří enzymů jsou regulovány stejnou regulační oblastí, aby se dosáhlo koordinované exprese genových produktů.
V nepřítomnosti laktózy je lac operon (meta) ve stavu represe. V tomto okamžiku se lac represor exprimovaný sekvencí I pod kontrolou promotorové sekvence PI váže na sekvenci O, což brání vazbě RNA polymerázy na sekvenci P a inhibuje iniciaci transkripce; pokud je přítomna laktóza, může být lac operon (meta) indukován. V tomto operonovém (meta) systému není skutečným induktorem samotná laktóza. Laktóza vstupuje do buňky a je katalyzována β-galaktosidázou, kde se přeměňuje na alolaktózu. Ta se jako induktorová molekula váže na represorový protein a mění konformaci proteinu, což vede k disociaci represorového proteinu od sekvence O a k transkripci. Isopropylthiogalaktosid (IPTG) má stejný účinek jako alolaktóza. Je to velmi silný induktor, který není metabolizován bakteriemi a je velmi stabilní, proto se široce používá v laboratořích.
Jak určit optimální koncentraci IPTG? Vezměte si jako příklad E. coli.
Geneticky modifikovaný kmen E. coli BL21 obsahující pozitivní rekombinantní pGEX (CGRP/msCT) byl inokulován do tekutého média LB s obsahem 50 μg·mL-1 Amp a kultivován přes noc při 37 °C. Výše uvedená kultura byla inokulována do 10 lahviček s 50ml čerstvého tekutého média LB s obsahem 50 μg·mL-1 Amp v poměru 1:100 pro expanzi kultury a když hodnota OD600 dosáhla 0,6~0,8, byl přidán IPTG do konečné koncentrace. Ta činí 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Po indukci při stejné teplotě a ve stejnou dobu byl z něj odebrán 1 ml bakteriálního roztoku a bakteriální buňky byly odebrány centrifugací a podrobeny SDS-PAGE za účelem analýzy vlivu různých koncentrací IPTG na expresi proteinu a následného výběru koncentrace IPTG s největší expresí proteinu.
Po experimentech se zjistí, že koncentrace IPTG není co nejvyšší. Je to proto, že IPTG má určitou toxicitu pro bakterie. Překročení koncentrace také zabije buňku; a obecně se očekává, že čím více rozpustného proteinu je v buňce exprimováno, tím lépe, ale v mnoha případech, když je koncentrace IPTG příliš vysoká, se vytvoří velké množství inkluzí v těle, ale množství rozpustného proteinu se sníží. Proto nejvhodnější koncentrace IPTG často není čím větší, tím lepší, ale čím nižší.
Účelem indukce a kultivace geneticky modifikovaných kmenů je zvýšit výtěžek cílového proteinu a snížit náklady. Expresi cílového genu ovlivňují nejen faktory kmene vlastní a expresní plazmid, ale také další vnější podmínky, jako je koncentrace induktoru, indukční teplota a indukční doba. Proto je obecně před expresí a purifikací neznámého proteinu nejlepší prostudovat indukční dobu, teplotu a koncentraci IPTG, aby se zvolily vhodné podmínky a dosáhlo se nejlepších experimentálních výsledků.
Čas zveřejnění: 31. prosince 2021