Kolem nás je mnoho neopěvovaných hrdinů, kteří se zdají být obyčejní, ale ve skutečnosti nám tiše hodně přispívají. Proteináza K je „neopěvovaným hrdinou“ v odvětví molekulární diagnostiky, ačkoli ve srovnání s „velkými a mocnými“ v tomto odvětví je proteináza K tak nenápadná, že jsme dlouho přehlíželi její význam. S vypuknutím nové koronavirové epidemie poptávka po proteináze K prudce vzrostla a nabídka doma i v zahraničí výrazně zaostává za spotřebou a všichni si najednou uvědomili, jak důležitá je proteináza K.
K čemu se používá proteináza K?
Proteináza K je serinová proteáza s proteolytickou enzymatickou aktivitou a může si udržet aktivitu v širokém rozsahu prostředí (pH (4-12,5), pufr s vysokým obsahem soli, vysoká teplota 70 °C atd.). Aktivita proteinázy K navíc není inhibována SDS, močovinou, EDTA, guanidin hydrochloridem, guanidin isothiokyanátem atd. a určité množství detergentu může také zvýšit aktivitu proteinázy K. Proteináza K se používá v lékařství (dezinfekce virů a mikrobů), potravinářství (změkčení masa), kůži (změkčení vlasů), výrobě vína (čiření alkoholu), přípravě aminokyselin (degradované peří), extrakci nukleových kyselin, hybridizaci in situ atd. Nejčastěji používanou aplikací je extrakce nukleových kyselin.
Proteináza K dokáže enzymolyzovat všechny druhy proteinů ve vzorku, včetně histonů, které jsou pevně vázány na nukleové kyseliny, takže nukleové kyseliny se mohou uvolnit ze vzorku a uvolnit do extraktu, což usnadňuje další krok extrakce a purifikace. Při detekci virové nukleové kyseliny je proteináza K jednou z důležitých složek roztoku pro odběr vzorků viru. Proteináza K dokáže rozložit a inaktivovat plášťový protein viru, což je bezpečnější během fáze transportu a detekce; proteináza K navíc dokáže také degradovat RNázu, která zabraňuje degradaci virové RNA a usnadňuje detekci nukleové kyseliny.
Proteinázu K, která se přes noc proslavila
Ať už v oblasti vědeckého výzkumu nebo v oblasti in vitro, extrakce nukleových kyselin je nejzákladnějším experimentem, takže proteináza K vždy hrála velmi důležitou roli. V minulosti však byla proteináza K mnohem méně známá, než jaká byla její role. Z velké části to bylo dáno tím, že vztah nabídky a poptávky proteinázy K byl velmi stabilní. Jen málo lidí by si myslelo, že by dodávky proteinázy K mohly být problémem.
S vypuknutím nové koronavirové epidemie prudce vzrostla poptávka po testování nukleových kyselin. Koncem června 2020 Čína provedla téměř 90 milionů nových testů na koronavirus a toto číslo je v celosvětovém měřítku ještě alarmující. V experimentech s extrakcí nukleových kyselin je pracovní koncentrace proteinázy K přibližně 50–200 μg/ml. Obecně je k extrakci vzorku nukleové kyseliny potřeba asi 100 μg proteinázy K. Ve skutečném použití se proteináza K často používá ve zvýšeném množství, aby se zvýšila účinnost extrakce nukleových kyselin. Detekce nukleových kyselin u nového koronaviru s sebou přinesla velkou poptávku po proteináze K. Původní rovnováha mezi nabídkou a poptávkou proteinázy K byla rychle narušena a proteináza K se přes noc stala důležitým materiálem pro prevenci epidemií.
Potíže s produkcí proteinázy K
Přestože s rozvojem epidemie si lidé začali vážit významu proteinázy K, je trapné, že kvůli její nízké popularitě se do její výroby zapojilo jen málo domácích společností. Když lidé chtějí zavést produkci proteinázy K, během výrobního procesu se ukázalo, že proteináza K je extrémně specifický protein. Rozšířit produkční kapacitu proteinázy K v krátkém čase je extrémně náročné.
Velkoobjemová produkce proteinázy K čelí následujícím obtížím
1. Nízká exprese
Proteináza K může nespecificky degradovat většinu proteinů a způsobit vážnou toxicitu pro hostitelskou buňku, v níž dochází k expresi. Proto je hladina exprese proteinázy K obecně velmi nízká. Screening expresních systémů a kmenů, které proteinázu K vysoce exprimují, obvykle vyžaduje delší cyklus.
2. Zbytky pigmentů a nukleových kyselin
Velkoobjemová fermentace zavádí velké množství pigmentu a zbytků nukleových kyselin hostitele. Je obtížné tyto nečistoty odstranit jednoduchým purifikačním procesem a složité čištění zvyšuje náklady a snižuje míru výtěžnosti.
3. Nestabilita
Proteináza K není dostatečně stabilní, může se sama enzymolyzovat a je obtížné ji stabilně skladovat při 37 °C po dlouhou dobu bez ochranného činidla.
4. Snadno se sráží
Při přípravě lyofilizovaného prášku proteinázy K je nutné, aby byl zajištěn vysoký obsah pevných látek v proteináze K, přidat lyofilizované ochranné činidlo ve vysoké koncentraci. Pokud však koncentrace proteinázy K dosáhne 20 mg/ml a více, snadno se vytvoří sraženina, což značně potíží s lyofilizací proteinázy K s vysokým obsahem pevných látek.
5. Velká investice
Proteináza K má silnou proteázovou aktivitu a v laboratoři dokáže hydrolyzovat jiné proteázy. Proto proteináza K vyžaduje specializované výrobní prostory, vybavení a personál pro výzkum, vývoj a výrobu.
Roztok proteinázy K od XD BIOCHEM
Společnost XD BIOCHEM disponuje rozvinutou platformou pro expresi a purifikaci proteinů a má bohaté zkušenosti s expresí a purifikací rekombinantních proteinů a optimalizací výrobních procesů. Díky rychlému vytvoření výzkumného a vývojového týmu byl překonán proces velkovýroby proteinázy K. Měsíční produkce lyofilizovaného prášku je více než 30 kg. Produkt má stabilní výkon, vysokou specifickou aktivitu enzymů a neobsahuje žádné zbytky hostitelského cytochromu a nukleových kyselin. Kontaktujte XD BIOCHEM. Získejte zkušební balíček (e-mail:sales@xdbiochem.comTel.: +86 513 81163739).
Technická řešení společnosti XD BIOCHEM zahrnují
Pomocí integrace vícekopiových plazmidů jsou selektovány kmeny s vysokou expresí a hladinou exprese 8 g/l, což překonává problém nízké hladiny exprese proteinázy K.
Zavedením vícestupňového purifikačního procesu byly úspěšně odstraněny zbytky hostitelského cytochromu a nukleových kyselin proteinázy K pod standardní hodnotou.
Prostřednictvím vysoce výkonného screeningu formulací ochranných pufrů byl vybrán pufr, který dokáže stabilně uchovávat proteinázu K při 37 °C.
Screeningové pufry překonávají problém snadné agregace a precipitace proteinázy K při vysokých koncentracích a pokládají základy pro lyofilizaci proteinázy K s vysokým obsahem pevných látek.
Vzorek proteinázy K XD BIOCHEM
Test stability proteinázy K XD BIOCHEM: po 80 dnech při pokojové teplotě nedojde k žádné významné změně aktivity.
Test stability proteinázy K XD BIOCHEM: po 80 dnech při pokojové teplotě nedojde k žádné významné změně aktivity.
Porovnání účinku extrakce nukleových kyselin pomocí proteinázy K XD BIOCHEM a konkurenčních produktů. V procesu extrakce nukleových kyselin se používá proteináza K XD BIOCHEM a kompetitivní proteináza K. Účinnost extrakce proteinázy K XD BIOCHEM je vyšší a hodnota Ct cílového genu je nižší.
Čas zveřejnění: 31. prosince 2021